蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰（PTM），在调节多种生物功能方面发挥着关键作用。研究表明，异常糖基化与包括炎症和肿瘤在内的多种疾病密切相关。因此，糖基化成为寻找疾病相关生物标志物的重要靶点。糖基化的宏观异质性（在不同位点发生）和微观异质性（每个位点表现出不同的糖型和结构）使得完整的糖肽分析相比传统的切糖分析更能够揭示蛋白层面的糖基化信息，这也正是糖蛋白组学研究的一项挑战。利用质谱对糖肽进行全面表征，已被证明是进行位点特异性糖蛋白组学分析和筛选生物标志物的有效工具。

近期，复旦大学乔亮教授团队与SCIEX团队及博士单宝珍（百蓁生物联合创始人）合作，在《Analytical Chemistry》上发表了题为“Quantitative Site-Specific Glycoproteomics Reveals Glyco-Signatures for Breast Cancer Diagnosis”的研究文章。该研究通过优化质谱分析方法和机器学习算法，从乳腺癌临床样本中鉴定和定量位点特异性的糖基化特征，最终确定了15种位点特异性聚糖，作为检测乳腺癌的新型生物标志物。这项研究不仅为乳腺癌的早期诊断提供了新的生物标志物，也为其他疾病的糖蛋白组学研究提供了创新思路和工具。

在研究方法上，研究团队对124份临床血清样本进行了糖蛋白组分析，样本包括40名乳腺恶性肿瘤患者、43名乳腺良性肿瘤患者及41名无乳腺疾病的对照组。研究通过优化ZenoTOF 7600质谱仪的动态碰撞能量设置进行糖肽数据的采集，并使用GlycanFinder等软件进行糖肽的鉴定与定量，最终通过主成分分析（PCA）和随机森林机器学习算法筛选出位点特异性的糖基化标志物，验证其在不同组间的差异表达，为乳腺癌的诊断提供潜在标志物。

研究结果显示建立了一个完整的N-糖肽检测流程，探索了糖肽鉴定的质谱信息学解决方案。通过对比不同固定和动态碰撞能量条件下的糖肽鉴定结果，发现动态碰撞能量在糖肽鉴定和位点特异性糖基鉴定数量上显著优于固定碰撞能量值。而与PEAKS® Studio和FragPipe糖肽解析软件相比，GlycanFinder在不同条件下的糖肽鉴定数量和得分表现更为稳定。

在对乳腺癌血清糖蛋白组进行分析时，研究团队共鉴定出6901个独特位点特异性糖链，涉及807个糖基化位点，主要为唾液酸化修饰。研究还探索了乳腺恶性肿瘤、良性肿瘤患者与对照组之间蛋白质组和糖蛋白组的定量结果，发现糖蛋白组在不同组间存在显著差异，而蛋白质组差异较小。差异表达的位点特异性糖链主要与凝血、糖胺聚糖结合、肽酶活性及免疫反应等功能相关。KEGG通路分析显示，补体和凝血级联反应在乳腺恶性肿瘤和良性肿瘤中显著改变，而胆固醇代谢在乳腺恶性和良性肿瘤中下调。

为筛选潜在的生物标志物，研究者使用随机森林模型构建了样本分类器，从位点特异性糖链中筛选出15个糖基标志物，用于乳腺癌诊断分类模型的构建。该模型在训练集上实现了0.98的AUC值，在验证集上达到了0.99的AUC值，展现出高诊断准确性。此外，对这15个候选生物标志物进行靶向质谱分析进一步确认了它们在乳腺癌诊断中的潜力。

综上所述，这篇文章展示了一种利用质谱进行完整糖肽表征的新方法，并阐明了其在临床血清样本中大规模位点特异性定量糖蛋白组分析的应用前景。研究结果表明，位点特异性糖蛋白组在疾病生物标志物研究中提供了令人振奋的机会，而这种方法在基础及临床糖蛋白组学研究中具有广泛的潜力。

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